\RequirePackage{ifpdf}
\ifpdf % We are running pdfTeX in pdf mode
\documentclass[pdftex]{kau-ukr}
\else
\documentclass{kau-ukr}
\fi

\usepackage{textcomp}
%\usepackage{hyperref}

\begin{document}

\selectlanguage{ukrainian}

% Поле нижче з порядковим номером статті буде заповнене технічним персоналом конференції. Будь ласка, не заповнюйте його самостійно.
\renewcommand{\ArticleNumber}{biol.03}

\FirstPageHeading

% Коротка назва статті%
\ShortArticleName{Введення вірусних векторів у нерв для оптогенетичного дослідження}

% Повна назва статті
\ArticleName{Введення аденоасоційованих вірусних векторів \\ у сідничний нерв щура для оптогенетичного\\ дослідження}

% Перелік авторів з вказанням афіляції шляхом індексування (як у прикладі)
\Author{Валерія УСТИМЕНКО~$^{\rm 1}$, Руслана ФИЛИМОНОВА~$^{\rm 2}$, Валентин ЯРИНКА~$^{\rm 3}$, \\ Нана ВОЙТЕНКО~$^{\rm 4}$}

% Скорочений перелік авторів
\AuthorNameForHeading{В.~Устименко, Р.~Филимонова, В.~Яринка, Н.~Войтенко}

\Address{$^{\rm 1)}$~Інститут фізіології ім. О.О.~Богомольця НАН України;\\
\hphantom{$^{\rm 1)}$}~Приватний заклад вищої освіти ``Академія Добробут'', Київ, Україна}
\EmailD{valusty@biph.kiev.ua}
\orcidD{0009-0000-2241-435X}

\Address{$^{\rm 2)}$~Київський академічний університет, Київ, Україна}
\EmailD{r.fylymonova@kau.edu.ua}
\orcidD{0009-0007-5528-488X}

\Address{$^{\rm 3)}$~Київський академічний університет, Київ, Україна}
\EmailD{v.yarynka@kau.edu.ua}
\orcidD{0009-0009-4905-3043}

\Address{$^{\rm 4)}$~Київський академічний університет;\\
\hphantom{$^{\rm 4)}$}~Приватний заклад вищої освіти ``Академія Добробут'', Київ, Україна}

\ArticleDates{Отримано 19 квітня 2025, у фінальній формі 7 червня 2025}

\Abstract{Травми периферичних нервiв нерiдко супроводжується значними фiзiологiчними порушеннями або втратою функцiональностi кiнцiвки і є значною клiнiчною проблемою сучасностi, особливо в умовах ведення бойових дiй. За статистикою пошкодження периферичних нервiв у цивiльних пацiєнтiв iз травмою становить близько 2,8\%, а актуальнi чисельнi данi серед вiйськовослужбовцiв вiдсутнi. На жаль, сучаснi методи встановлення морфофункцiонального вiдновлення нервiв не дають стабiльних результатiв та все ще потребують подальшого розвитку.
У цьому дослiдженнi ми перевiряли ефективнiсть введення аденоасоцiйованих вiрусних векторiв, що забезпечують експресiю свiтлочутливого йонного каналу каналродопсину, як потенцiйного методу для вiдстеження регенерацiйного процесу пошкодженого периферичного нерва. Фотоактивацiя цих йонних каналiв у вiдновлених периферичних рецепторах потенцiйно може дозволити картувати зони вiдновлення iннервацiї. Спершу було проведене оперативне втручання з iн'єкцiєю векторiв AAV1-CAG-ChR2-mCherry пiд епiневральну оболонку у проксимальному кiнцi сiдничного нерва в напрямку спинного мозку. Через п'ять тижнiв пiсля операцiї експресiю каналродопсину в периферичних закiнченнях було перевiрено за допомогою стимуляцiї свiтлом довжиною хвилi 450~нм, яка викликала вiдсмикування оперованої кiнцiвки вiд скляної поверхнi. Результати свiдчать про те, що введення аденоасоцiйованих вiрусних векторiв має дiагностичний потенцiал у дослiдженнi вiдновлення периферичних нервiв пiсля травм.}

\Keywords{травма периферичного нерву; сідничий нерв; каналродопсин 2; аденоасоційовані вірусні вектори; іннервація; регенерація}

\section{Вступ}

Травми периферичних нервiв (ТПН) можуть мати рiзнi причини, якi можна подiлити на двi основнi групи --- нещаснi випадки або бойовi травми та медичнi помилки, спричинені людським фактором. Такi патологiчнi змiни супроводжуються порушенням сенсорних та рухових характеристик або повною втратою функцiональностi кiнцiвки \cite{Lopes2022}. Основна проблематика ТПН наразi полягає у низькому рівні регенерацiї без можливостi повного вiдновлення основних функцiй, що становить значну проблему у сферi громадського здоров'я \cite{Wojtkiewicz2015}. Наслiдками неповного вiдновлення нерва є фiзична слабкiсть, м'язова атрофiя, хронiчний больовий синдром та iнвалiднiсть \cite{Wojtkiewicz2015, Wang2019}. Незважаючи на новітні терапевтичні розробки та низьку статистику виявлення (від 1,5 до 3\% від усіх травм), ТПН має нестабільні результати лікування \cite{Althagafi2023, Yegiyants2010}.

У дослiдженнях травм нервової системи широко використовуються твариннi моделi, зокрема гризуни. Однiєю з найбiльш поширених є щури, у яких для оцiнки посттравматичної ноцицепцiї використовується низка стандартизованих поведiнкових тестiв \cite{Rayner2020}. Наприклад, тест Хаґрiвса спрямований на оцiнку больової сенситизацiї шляхом термічного впливу \cite{Cheah2017}. Ще одним поведiнковим тестом, що спрямований на перевiрку ноцицепцiї, є сенсорний тест фон Фрея, який дозволяє оцiнити механiчну чутливiсть кiнцiвки до стимулiв рiзної сили \cite{Zumbusch2024}.

Водночас дослiдження функцiональної регенерацiї привернули значну увагу через вiдсутнiсть оптимального пiдходу до її оцінки. Це спричинило пошук нового шляху для чiткого визначення схеми iннервацiї окремих шкiрних зон кiнцiвок рiзними периферичними нервами та уникнення нечiткої оцiнки стану через дiлянки перекриття \cite{Kambiz2014}. Для створення оптимального пiдходу дослiджується можливiсть застосування оптогенетичних методик для оцiнки ступеня та швидкості морфофункцiонального вiдновлення нерву пiсля травми \cite{Xu2020}. Загалом, оптогенетика --- це методика, яка ґрунтується на введеннi в клiтини свiтлочутливиx бiлкiв, таких як каналродопсин 2 (channelrhodopsin 2, ChR2) \cite{Hegemann2013}. ChR2 є свiтлозалежним йонним каналом. Внаслiдок дiї свiтла з довжиною хвилi в межах 463--590~нм ChR2 активується, та змiнює свою конформацiю таким чином, що це спричиняє вiдкриття йонної пори \cite{Hegemann2013, Schneider2015}. ChR2 є неселективним, а тому пропускає йони за градiєнтом концентрацiї, та сприяє надходженню катiонiв всередину клітини \cite{Schneider2015}. Коли ChR2 локалiзується в мембранах нейронiв, його активацiя викликає деполяризацiю мембрани, що може призвести до генерацiї потенцiалу дiї.

Для доставки генетичного матерiалу в цiльовi клiтини використовуються вiруснi вектори, зокрема аденоасоцiованi (adeno-associated virus, AAV) \cite{Xu2020}. Вони модифiкованi для мiнiмiзацiї токсичностi та патогенностi, а їхня безпека досягається шляхом видалення генiв, необхiдних для реплiкацiї генетичного матерiалу та синтезу капсидних бiлкiв, що робить вектори нездатними для автономного розмноження \cite{Xia2024}. Окрiм цього, AAV навiть у немодифiкованому станi не здатнi до самостiйної реплiкацiї, адже для цього їм потрiбна експресiя додаткових генiв, яка в природi досягається у випадку супутнього зараження адено- або герпесвiрусами, що збiльшує їхнiй профiль безпеки \cite{PenaudBudloo2018}.

Специфiчнiсть трансдукцiї AAV залежить вiд серотипу. Вона обумовлена рiзницею у структурi капсидiв, що дає їм можливiсть зв'язуватися з рiзними типами рецепторiв на поверхнi клiтин, за рахунок чого такі вектори можна використовувати для трансдукцiї генетичного матерiалу в рiзнi типи клiтин органiзму \textit{in vivo} \cite{Srivastava2016}. Зокрема AAV вектори 1-го серотипу (AAV1) характеризуються високою ефективнiстю при використаннi для трансдукцiї периферичних нейронiв, глiальних та м'язових клiтин \cite{Ocarroll2021}. Введення даного типу векторiв шляхом субепiневральної iн'єкцiї має забезпечити таргетовану експресiю цiльового бiлка у нервовiй тканинi.

Продуктом гену, що переноситься обраним вектором, був ChR2 злитий з флуоресцентним бiлком mCherry. Коекспресiя ChR2 з mCherry потенцiйно забезпечить як контроль активностi нейронiв шляхом оптогенетичної стимуляцiї ChR2 для пiдтвердження вiдновлення iннервацiї пiсля травми периферичного нерва, так і дозволить вiзуалiзувати шляхи реiннервацiї трансдукованих нейронiв за допомогою флуоресценцiї mCherry, що критично важливо для оцiнки регенерацiї пiсля травми.

\section{Матеріали та методи}

\subsection*{Об'єкт дослідження}

В експериментах використовували 3 щурiв-самцiв лiнiї Wistar, масою 240--280~грам, вiком два мiсяцi. Тварини були утриманi у вiварiї Iнституту фiзiологiї iм. О.О.~Богомольця НАН України за стандартних умов у клiтках по 1--3 особини, за температури 20--23~$^\circ$С та режимом освітлення 12:12 годин день/нiч зi свiтлом з 9:00. Усi манiпуляцiї з тваринами проводились згiдно з положеннями Європейської конвенцiї iз захисту хребетних тварин (Страсбург, 1986), Закону України «Про захист тварин вiд жорстокого поводження» (2006) та Порядку проведення науковими установами дослiдiв, експериментiв на тваринах (2012).

\subsection*{Проведення субепіневральних ін'єкцій}

Для проведення субепiневральних iн'єкцiй використовували 2 мМ розчин флуоресцеїну в 0,9\% NaCl (Юрiя-Фарм, Україна) та аденоасоцiйованi вiруснi вектори AAV1-CAG-hChR2 (H134R)-mCherry-WPRE.SV40 (Addgene, 100054-AAV1). Шприц (Hamilton, 7635-01) заповнювали вазелiновою олiєю, фiксували голку та пiд'єднували попередньо заповнену вазелiновою олiєю магiстраль (Intramedic, 427406). Систему фiксували на мiкроманiпуляторi (Starrett, 262M) та дозаповнювали вiльний об'єм розчином аденовiрусних векторiв, змішаним з попередньо заготовленої аліквоти флуоресцеїну, пiсля чого надягали голку (World Precision Instruments, NF33BV).

Тварину анестезували 3\% iзофлураном зi швидкiстю подачi 1,5 л/хв, пiсля чого переносили на пiдiгрiваючий килимок iз пiдтримкою температури на рiвнi 35~$^\circ$С з продовженням подачi iзофлурану у концентрацiї вiд 1,5 до 2,5\%, постiйно слiдкуючи за диханням та загальним станом тварини. Лiве стегно голили та обробляли 10\% розчином Бетадину (EGIS, Угорщина) перед наступними дiями, якi виконувались з використанням стереомiкроскопа зi збiльшенням 8х (Olympus, SZX7). Скальпелем розрiзали шкiру та розводили м'язи за допомогою ретрактора. Пiсля вiзуалiзацiї сiдничного нерва та вiддiлення його вiд навколишнiх тканин проводили iн'єкцiю пiд епiневральну оболонку у проксимальному кiнцi в напрямку до спинного мозку. Вводили 2 мкл розчину вiрусних векторiв та флуоресцеїну зi швидкiстю подачi 1 мкл/хв, пiсля чого утримували голку у точцi iн'єкцiї впродовж 5 хвилин. Для перевiрки поширення розчину iпсилатеральним нервом за допомогою ультрафiолетового випромінювання у темнiй кiмнатi.

За допомогою атравматичної голки та шовного матерiалу розмiром 2/0 накладали по 2--4 вузловi шви на м'язи та шкiру. Пiсля зшивання проводили повторну обробку 10\% розчином Бетадину. У контрлатеральну кiнцiвку пiдшкiрно вводили антибiотик Бiцилiн-5 (150 тис. одиниць; Київмедпрепарат, Україна) та протизапальний та iмуносупресивний засіб дексаметазону (2~мг/мл; KRKA, Словенiя). Пiсля проведення оперативного втручання тварину впродовж 5 хвилин залишали пiд наглядом на термокилимку для вiдходу вiд анестезiї. Пiсля цього тварина перебувала ще 10 хвилин у чистому контейнерi для повного виходу з анестезованого стану. Наприкiнцi тварину повертали до клiтки з постiйним доступом до їжi та води.

\subsection*{Тестування тварин на термічну чутливість методом Хаґрівса}

Для кiлькiсного визначення термiчного порогу за 30--40 хвилин до початку тестування для звикання тварин розмiщували в камерi з прозорим дном з органiчного скла, що розсіює інфрачервоне випромінювання~\cite{Hargreaves1988}. Пiд час тесту впевнювалися, що щур перебуває у станi неспання i не пiд час грумiнгу. Сенсор iз джерелом випромiнювання (Ugo Basile, 37370UB) направляли на пiдошовну поверхню задньої кiнцiвки. Iнтенсивнiсть теплового стимулу була встановлена на 70 одиниць. Тестування проводили на контрольнiй та оперованiй заднiй кiнцiвцi по 5 разiв з iнтервалом вiд 3 до 5 хвилин. Латентний перiод реакцiї фiксувався приладом автоматично. Поведiнкове тестування проводили щотижня з моменту проведення операцiї.

\subsection*{Тестування тварин на механічну чутливість методом фон Фрея}

Для оцінки механічної чутливості тварин розміщували окремо у клітки з сітчастим дном з попереднім звиканням впродовж 30 хвилин до початку тестування. Для уникнення хибнонегативної відповіді на подразник контролювали, що щур перебуває у станi неспання i не в процесi грумiнгу. Для тестування використовували набір калiброваних монофiламентiв Touch-Test (Stoelting, 58011), якi пiдводили до пiдошовної поверхнi задньої лапи пiд прямим кутом до моменту згинання,  прикладаючи визначену силу протягом 2 секунд. У тестi використовували методику ``up-down'', починаючи з фiламенту 26 грамiв, який був обраний завчасно як визначений середнiй порiг для щурiв \cite{Chaplan1994,Dixon1980}. Прикладання монофiламенту проводили з латерального боку стопи задньої кiнцiвки \cite{Cobianchi2014}. За позитивної реакцiї (вiдсмикування лапи, облизування, вокалiзацiя пiд час подразнення або вiдразу пiсля) використовували фiламент з меншою жорсткiстю, за негативної --- з бiльшою. Пiсля першої змiни реакцiй (позитивна змінилась на негативну, або навпаки) тест тривав до реєстрацiї 4 послiдовних вiдповiдей. Проводили мiнiмум 6 вимiрювань для оптимального розрахунку значення, при якому в 50\% випадкiв пiддослiдна тварина реагує на подразник, використовуючи модифіковану формулу LD50 \cite{Bonin2014,Deuis2017}. Поведінкове тестування проводили щотижня з моменту проведення операції.

\subsection*{Оптогенетичне тестування тварин}

Тварин помiщали в контрольоване середовище для тестування для аклiматизацiї перед тестом на 15--30 хвилин. Кiнчик оптоволокна (200~нм, $NA = 0{,}22$), пiд'єднаного до лазерного дiодного волоконного свiтловоду (Doric, LDFLS 450/07--520/060), розмiщували поруч з задньою кiнцiвкою, що дослiджувалася пiд час експерименту. Стимуляцiя здiйснювалася за довжини свiтла 450 нм та за виставленої iнтенсивностi вiд 60 до 110~мА (у шкалі приладу; інтенсивність світла була в діапазоні 50--120~мВт) з кроком 5~мА. Мiжстимульний iнтервал становив не менше однiєї хвилини. Для уникнення помилкової iнтерпретацiї через термiчний вплив замiсть оптичної активацiї максимальна тривалiсть стимулу складала одну секунду. Контроль за тривалiстю стимулу здiйснювався з використанням TTL мiкроконтролера (\url{https://github.com/Belan-Lab/TTL-trigger-timer}). У разi вiдсутностi реакцiї iнтенсивнiсть збiльшували до наступного рiвня. Якщо реакцiя спостерiгалася, лазер завчасно деактивували та повторювали тестування ще чотири рази. У випадку вiдсутностi реакцiї у щонайменше 50\% випадкiв, iнтенсивнiсть збiльшували з кроком в 5~мА.

\subsection*{Статистична обробка даних}

Статистичний аналiз результатiв поведiнкових тестiв проводився з використанням мови програмування R та iнтегрованого середовища програмування RStudio. Аналiз проводили з урахуванням фактора часу, експериментальної групи та кiнцiвки тварини (оперована, L або контрлатеральна,~R). Для перевiрки нормальностi розподiлу даних використовували тест Шапiро--Вiлка. Данi в усiх групах були розподiленi нормально ($p > 0{,}05$), проте, зважаючи на величину вибiрки ($n = 3$) надалi використовували непараметричнi методи для уникнення помилки I~роду. Для оцiнки статистичних вiдмiнностей мiж групами та кiнцiвками тварини (оперована, L або контрлатеральна, R) використовували непараметричний тест Вiлкоксона; рiзницю вважали значущою за $p < 0{,}05$.

Кореляцiйний аналiз проводили з використанням методу Спiрмена. Силу кореляцiї визначали наступним чином: дуже слабка кореляцiя --- 0,00--0,19; слабка кореляцiя --- 0,20--0,39; помiрна кореляцiя --- 0,40--0,59; сильна кореляцiя --- 0,60--0,79; дуже сильна кореляцiя~--- 0,80--1,00.

\section{Результати дослідження}

На етапі вiдлагодження методу було перевiрено успішність проведення iн'єкцiй та дослiджено поширення вiрусного вектору пiд зовнiшньою оболонкою нерва (епiневрiєм). Вiзуалiзацiя розподiлу вектору була проведена за допомогою додавання флуоресцеїну до алiквоти AAV вектору. Було виявлено, що розчин широко поширюється пiд епiневральною оболонкою нерва не тiльки в напрямку введення вiрусу (проксимальному, до спинного мозку), але й у протилежному (дистальному) напрямку (рис.~\ref{figure1}\,(А)).

\begin{figure}[ht]
    \centering
    \includegraphics[scale=0.175]{1.png}
    \caption{Змiни чутливостi кiнцiвок пiддослiдних тварин до свiтла з довжиною хвилi 450~нм пiсля iн'єкцiї AAV вектора в нерв.
    (А)~Вiзуалiзацiя поширення розчину 2 мМ флуоресцеїну пiсля субепiневральної iн'єкцiї в сiдничний нерв щура. (Аа) За видимого свiтла.
    (Аb)~За УФ-випромiнювання.
(B)~Проведення оптогенетичного тестування у щурiв.
(Ba)~Пiдведення оптоволокна до задньої кiнцiвки щура.
(Bb)~Стимуляцiя кiнцiвки свiтлом з довжиною хвилi 450~нм. (С)~Змiни порогу чутливостi~(мА) до свiтлового стимулу дослiджуваних тварин ($n = 3$) в прооперованiй та контралатеральнiй кiнцiвках впродовж експерименту.
(D) Порiвняння порогу чутливостi~(мА) до свiтлового стимулу прооперованої лiвої та контрлатеральної правої кiнцiвок на початку (2-й тиждень) та в кiнцi (5~тиждень) експерименту ($n = 3$).
(E)~Порiвняння порогу чутливостi (мА) до свiтлового стимулу на початку (2~тиждень) та в кiнцi (5-й тиждень) експерименту для прооперованої лiвої та контрлатеральної правої кiнцiвок.
L~--- прооперована лiва кiнцiвка; R~--- контрлатеральна права кiнцiвка; X~--- вiдсутнiсть реакцiї; сiра пунктирна лiнiя --- медiана.}
    \label{figure1}
\end{figure}

Для пiдтвердження експресiї ChR2 нами було перевiрено реакцiю тварини на оптогенетичну стимуляцiю у рiзнi часовi промiжки після операції. Для цього щура розмiщали на склянiй платформi та пiдводили оптичне волокно пiд нижню поверхню його стопи (рис.~\ref{figure1}\,(Ba)), контролюючи, що тварина перебуває у станi спокою. Далі проводили стимуляцiю свiтлом iз довжиною хвилi~450 нм впродовж 1 секунди за рiзних iнтенсивностей (рис.~\ref{figure1}\,(Bb)). У~результатi було виявлено, що показники оптогенетичного дослiдження на обох кiнцiвках пiддослiдних тварин мають відмінні результати за реакцiєю залежно вiд iнтенсивностi стимуляцiї (рис.~\ref{figure1}\,(C)). Тим не менш, спостерiгалася загальна тенденцiя до поступового зниження порогових значень, що може свiдчити про пiдвищення чутливостi до свiтлового стимулу, спричинене поступовою експресiєю ChR2 та його вбудовуванням в мембрани аксонiв.

Додатково порiвнювали пороги чутливостi мiж другим тижнем після операції, коли вперше спостерiгалася реакцiя у щурiв, та фiнальним, п'ятим, тижнем для прооперованої лiвої та контрлатеральної правої кiнцiвок (рис.~\ref{figure1}\,(D--E)). Для оперованої кiнцiвки реакцiя в бiльшостi випадкiв спостерiгалася вперше на другий післяоперацiйний тиждень за стимуляцiї за iнтенсивностi 110~мА за шкалою приладу i на п'ятий тиждень проявлялась за інтенсивності 100~мА, рiзниця не є статистично значимою ($p > 0{,}05$, $n = 3$). Водночас у бiльшостi випадкiв права контралатеральна кiнцiвка демонструвала несуттєвi змiни порогового значення та реакцiю за 110~мА лише на п'ятий тиждень, рiзниця також не є статистично значимою ($p > 0{,}05$, $n = 3$). Отже, статистично значущих змiн порогiв чутливостi мiж другим та п'ятим тижнями пiсля операцiї як для оперованої, так i для контрлатеральної кiнцiвки щурiв, немає.\looseness=-1

З метою валiдацiї розробленої методики для обстеження сенсорної функцiї тварин також було проведено поведiнковi тести для дослiдження термічної чутливостi методом Хаґрiвса (рис.~\ref{figure2}\,(А)). Cпочатку проводили порiвняння значень порогiв теплової чутливостi для оперованої лiвої та контрлатеральної правої кiнцiвок на другому та п'ятому тижнях (рис.~\ref{figure2}\,(А)). Було виявлено, що для оперованої кiнцiвки на другому тижнi медiанне значення порогу становило $15{,}0$ $[12{,}1; 17{,}9]$ секунд, до п'ятого тижня воно знизилося до $12{,}7$ $[12{,}0; 17{,}8]$ секунд, рiзниця не є статистично значимою ($p > 0{,}05$) (рис.~\ref{figure2}\,(Аа)). Для контрлатеральної кiнцiвки на другому тижнi порiг був на рiвнi $13{,}7$ $[11{,}7; 17{,}1]$ секунд i до п'ятого тижня незначно ($p > 0{,}05$) знизився до $12{,}7$ $[12{,}3; 14{,}4]$ секунд. Порiвняння значень порогу для лiвої та правої кiнцiвок в рiзних часових точках показало вiдсутнiсть значущої рiзницi впродовж всього перiоду тестування ($p > 0{,}05$) (рис.~\ref{figure2}\,(Аb)). Цi результати вказують на вiдсутнiсть значних змiн чутливостi тварини до теплових стимулiв як для оперованої, так i для контрлатеральної кiнцiвки протягом всього перiоду дослiдження, та свiдчать про те, що операцiйне втручання не призвело до розвитку патологiчних змiн та супутньої гiпералгезiї, яка могла вплинути на результати оптогенетичного тестування.

\begin{figure}[ht]
    \centering
    \includegraphics[scale=0.175]{2.png}
    \caption{Порiвняння змiн чутливостi кiнцiвок пiддослiдних тварин з другого по п'ятий тиждень пiсля iн'єкцiї.
    (А) Порiвняння порогу чутливостi до термiчного стимулу за результатами тесту Хаґрiвса ($n = 3$).
    (Аа) Змiни порогу термочутливостi на початку (2~тиждень) та в кiнцi (5 тиждень) експерименту мiж прооперованою лiвою та контрлатеральною правою кiнцiвками.
    (Аb) Порiг термочутливостi для прооперованої лiвої та контрлатеральної правої кiнцiвок на початку (2 тиждень) та в кiнцi (5 тиждень).
    (B) Порiвняння порогу чутливостi до механiчного стимулу за результатами тесту фон Фрея ($n = 3$).
    (Ba) Змiни порогу механочутливостi на початку (2~тиждень) та в кiнцi (5 тиждень) експерименту мiж прооперованою лiвою та контрлатеральною правою кiнцiвками.
    (Bb) Порiг механочутливостi для прооперованої лiвої та контрлатеральної правої кiнцiвок на початку (2 тиждень) та в кiнцi (5 тиждень).
    (С) Зведене порiвняння порогiв чутливостi за оптогенетичним тестуванням, тестами фон Фрея та Хаґрiвса.
    (D) Кореляцiйнi матрицi взаємозв'язку мiж показниками механочутливостi, термочутливостi та оптогенетичних дослiджень.
    L~--- прооперована лiва кiнцiвка; R~--- контрлатеральна права кiнцiвка; МЧ --- порiг механочутливостi; О --- порiг чутливостi до оптичного стимулу; ТЧ~--- порiг термочутливостi; сiра пунктирна лiнiя --- медiана.}
    \label{figure2}
\end{figure}

Для оцiнки впливу оперативного втручання на функцiональний стан кінцівки використано тест фон Фрея (рис.~\ref{figure2}\,(В)). Було визначено, що медiанне значення порогу тактильної чутливостi для лiвої кiнцiвки на другому тижнi експерименту становило $24{,}4$ $[22{,}1; 27{,}7]$ грама i на п'ятому тижні було на рiвнi $22{,}8$ $[14{,}3; 31{,}1]$ грама, проте ця рiзниця є статистично незначимою ($p > 0{,}05$, $n = 3$) (рис.~\ref{figure2}\,(Ва)). Для контрлатеральної кiнцiвки даний показник досягав~$30{,}9$ $[27{,}7;35{,}2]$ грама на другому тижнi i на п'ятому фiксувався на рiвнi $21{,}21$ $[16{,}4;26{,}0]$ грама ($p > 0{,}05$, $n = 3$). Як i в випадку з тестом Хаґрiвса, порiвняння значень порогу для лiвої та правої кiнцiвок в рiзних часових точках (рис.~\ref{figure2}\,(Bb)) не вказало на наявнiсть значимої рiзницi впродовж усього термiну тестування ($p > 0{,}05$, $n = 3$).

Додатково було дослiджено можливi кореляцiї мiж нормалiзованими результатами оптогенетичного (О) тесту з тестами Хаґрiвса (оцiнка термочутливостi, ТЧ) i фон Фрея (оцiнка механочутливостi, МЧ) (рис.~\ref{figure2}\,(С)). Результати тесту Хаґрiвса демонструють розбiжностi з iншими методами, що вказує на оцiнку вiдмiнних сенсорних механiзмiв. Одночасно спостерiгалася схожiсть динамiки мiж оптогенетичним тестом та тестом фон Фрея для обох кiнцiвок.

Для пiдтвердження цих спостережень було додатково застосовано кореляцiйний аналiз методом Спiрмена (рис.~\ref{figure2}\,(D)). Виявили помiрну позитивну кореляцiю ($r = 0{,}53$) мiж результатами оптичної та механiчної стимуляцiй прооперованої кiнцiвки (рис.~\ref{figure2}\,(Da)). Це може свiдчити про активацію однакових типів ноцицепторів у вiдповiдь на різні стимули, проте вiдсутнiсть статистичної значущостi ($p > 0{,}05$) не дозволяє робити впевненi висновки щодо цього. Водночас кореляцiя мiж результатами тестiв Хаґрiвса та фон Фрея є дуже слабкою ($r = 0{,}07$, $p > 0{,}05$), що пiдтверджує незалежнiсть механiзмiв термо- та механочутливостi. Для оптичного тесту та тесту Хаґрiвса кореляцiя була слабко негативною ($r = -0{,}34$, $p > 0{,}05$).

Результати тестування контрлатеральної кiнцiвки схожi: спостерiгалася помiрна позитивна кореляцiя ($r = 0{,}56$, $p > 0{,}05$) мiж результатами оптогенетичного тесту та фон Фрея для прооперованої кiнцiвки, та дуже слабка кореляцiя за порiвняння результатiв тестiв Хагрiвза та фон Фрея ($r = 0{,}02$, $p > 0{,}05$) (рис.~\ref{figure2}\,(Db)). Єдина суттєва вiдмiннiсть вiдзначалась у порiвняннi результатiв оптогенетичного пiдходу та тесту Хаґрiвса: було виявлено дуже слабку негативну кореляцiю ($r = -0{,}03$, $p > 0{,}05$) тодi як для лiвої кiнцiвки цей показник був слабко негативним ($r = -0{,}34$, $p > 0{,}05$), що може бути пов'язано з експресiєю та подальшою активацiєю ChR2, але це потребує додаткових дослiджень через вiдсутнiсть статистичної значимостi. Таким чином, отриманi результати свiдчать про наявнiсть часткових кореляцiйних зв'язкiв мiж рiзними типами ноцицептивних стимуляцiй, проте вiдсутнiсть статистичної значущостi ($p > 0{,}05$) усiх виявлених коефiцiєнтiв не дозволяє робити категоричнi висновки щодо спiльних механiзмiв активацiї та потребує дослiдження на бiльшiй вибiрцi.

\section{Висновки}

Під час проведення дослідження було розроблено методику для проведення субепiневральних iн'єкцiй в проксимальну частину периферичного нерва. Такий спосiб iн'єктування AAV векторiв сприяє їх ефективному поширенню уздовж нерва пiд епiневрiєм як у проксимальному, так i дистальному напрямках з мiнiмiзацiєю супутнього пошкодження.

Водночас поведiнковi тести, що спрямованi на виявлення термічної та механiчної чутливостi, демонструють вiдсутнiсть статистично значимої рiзницi мiж оперованою та контрлатеральною кiнцiвками, що вказує на вiдсутнiсть розвитку патологiчних змiн пiсля хірургічного втручання. Помiрна кореляцiя мiж результатами оптогенетичного тесту та тесту фон Фрея на обох кiнцiвках може вказувати на активацію однакових типів ноцицепторів у вiдповiдь на різні стимули, проте вiдсутнiсть статистичної значущостi цих кореляцiй не дозволяє робити остаточних висновкiв щодо спiвiннервацiї --- для пiдтвердження необхiднi додатковi дослiдження з розширеною вибiркою та альтернативними методами оцiнки.

Також було пiдiбрано умови для проведення сенсорного тесту для таргетованого дослiдження сiдничного нерва, який у перспективi може бути використано для оцiнки вiдновлення нерва пiсля травми. Оптогенетичне дослiдження виявило гетерогеннi реакцiї на стимули залежно вiд їхньої iнтенсивностi, проте має загальну тенденцiю до зниження порогiв чутливостi, що вiдповiдає поступовiй експресiї та вбудовуванню ChR2 в мембранах сенсорних нейронiв, досягаючи свого максимуму на п'ятий тиждень пiсля iн'єкцiї.

Таким чином запропонований пiдхiд iз використанням AAV-векторiв та оптогенетичної стимуляцiї демонструє потенцiал як iнструмент для дiагностики та монiторингу регенерацiйних процесiв у периферичнiй нервовiй системi. Цей метод може слугувати основою для розробки нових дiагностичних та оцiнки нових терапевтичних пiдходiв.

\subsection*{Подяки}

Щиро вдячні керівнику відділу біофізики сенсорної сигналізації Інституту фізіології ім. О.О.~Богомольця Павлу Білану та інженеру Борису Оліфірову за їхній внесок у розробку дизайну експерименту.

\subsection*{Фінансування}

Дослідження було здійснено за підтримки гранту Національного фонду досліджень України (проєкт № 2021.01/0328), наданого Нані Войтенко.

\phantomsection
\renewcommand{\refname}{Список використаних джерел}

\pdfbookmark[1]{References}{ref}
\begin{thebibliography}{99}
\footnotesize\itemsep=0pt

\bibitem{Althagafi2023} Althagafi A., Nadi M., Acute nerve injury, in \textit{StatPearls}, StatPearls Publishing, Treasure Island (FL), 2023.

\bibitem{Bonin2014} Bonin R.P., Bories C., De Koninck Y., \href{https://doi.org/10.1186/1744-8069-10-26}{A simplified up-down method (SUDO) for measuring mechanical nociception in rodents using von Frey filaments}, \textit{Mol. Pain} \textbf{10} (2014), 26.

\bibitem{Ocarroll2021} O'Carroll S.J., Cook W.H., Young D.,  \href{https://doi.org/10.3389/fnmol.2020.618020}{AAV targeting of glial cell types in the central and peripheral nervous system and relevance to human gene therapy}, \textit{Front. Mol. Neurosci.} \textbf{13} (2021), 618020.

\bibitem{Chaplan1994} Chaplan S.R., Bach F.W., Pogrel J.W., Chung J.M., Yaksh T.L.,
\href{https://doi.org/10.1016/0165-0270(94)90144-9}{Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw}, \textit{J. Neurosci. Methods} \textbf{53} (1994), 55--63.

\bibitem{Cheah2017} Cheah M., Fawcett J.W., Andrews M.R., \href{https://doi.org/10.21769/BioProtoc.2506}{Assessment of thermal pain sensation in rats and mice using the Hargreaves test}, \textit{Bio-Protocol.} \textbf{7} (2017), no.~16, e2506,2017.

\bibitem{Cobianchi2014} Cobianchi S., de Cruz J., Navarro X., \href{https://doi.org/10.1016/j.expneurol.2014.02.008}{Assessment of sensory thresholds and nociceptive fiber growth after sciatic nerve injury reveals the differential contribution of collateral reinnervation and nerve regeneration to neuropathic pain}, \textit{Exp. Neurol.} \textbf{255} (2014), 1--11.

\bibitem{Deuis2017} Deuis J.R., Dvorakova L.S., Vetter I.,  \href{https://doi.org/10.3389/fnmol.2017.00284}{Methods used to evaluate pain behaviors in rodents}, \textit{Front. Mol. Neurosci.} \textbf{10} (2017), 284.

\bibitem{Dixon1980} Dixon W.J., \href{https://doi.org/10.1146/annurev.pa.20.040180.002301}{Efficient analysis of experimental observations}, \textit{Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol.} \textbf{20} (1980), 441--462.


\bibitem{Hargreaves1988} Hargreaves K., Dubner R., Brown F., Flores C.,  Joris J., \href{https://doi.org/10.1016/0304-3959(88)90026-7}{A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia}, \textit{Pain} \textbf{32} (1988), no.~1, 77--88.

\bibitem{Hegemann2013} Hegemann P., Nagel G., \href{https://doi.org/10.1002/emmm.201202387}{From channelrhodopsins to optogenetics}, \textit{EMBO Mol. Med.} \textbf{5} (2013), no.~2, 173--176.

\bibitem{Kambiz2014} Kambiz S., Baas M., Duraku L.S., Kerver A.L., Koning A.H., Walbeehm E.T., Ruigrok T.J., \href{https://doi.org/10.1016/j.jneumeth.2014.03.015}{Innervation mapping of the hind paw of the rat using Evans Blue extravasation, optical surface mapping, and CASAM} \textit{J. Neurosci. Methods} \textbf{229} (2014), 15--27.

\bibitem{Lopes2022} Lopes B., Sousa P., Alvites R. et al., \href{https://doi.org/10.3390/ijms23020918}{Peripheral nerve injury treatments and advances: One health perspective}, \textit{Int.~J. Mol. Sci.} \textbf{14} (2022), no.~2, 918.

\bibitem{PenaudBudloo2018} Penaud-Budloo M., Fran\c{c}ois A., Cl\'ement N., Ayuso E., \href{https://doi.org/10.1016/j.omtm.2018.01.002}{Pharmacology of recombinant adeno-associated virus production}, \textit{Mol. Ther. Methods Clin. Dev.} \textbf{8} (2018), 166--180.

\bibitem{Rayner2020} Rayner M.L.D., Brown H.L., Wilcox M., Phillips J.B., Quick T.J., \href{https://doi.org/10.1016/j.bjps.2019.10.007}{Quantifying regeneration in patients following peripheral nerve injury}, \textit{J.~Plast. Reconstr. Aesthet. Surg.} \textbf{73} (2020), 201--208.

\bibitem{Ronchi2023} Ronchi G., Fregnan F., Muratori L., Gambarotta G., Raimondo S., \href{https://doi.org/10.3390/ijms24031818}{Morphological methods to evaluate peripheral nerve fiber regeneration: A comprehensive review}, \textit{Int. J. Mol. Sci.} \textbf{24} (2023), no.~3, 1818.

\bibitem{Schneider2015} Schneider F., Grimm C., Hegemann P., \href{https://doi.org/10.1146/annurev-biophys-060414-034014}{Biophysics of channelrhodopsin}, \textit{Ann. Rev. Biophys.} \textbf{44} (2015), 167--186.

\bibitem{Srivastava2016} Srivastava A., \href{https://doi.org/10.1016/j.coviro.2016.08.003}{In vivo tissue-tropism of adeno-associated viral vectors}, \textit{Curr. Opin. Virol.} \textbf{21} (2016), 75--80.

\bibitem{Wang2019} Wang M.L., Rivlin M., Graham J.G., Beredjiklian P.K., \href{https://doi.org/10.1080/03008207.2018.1489381}{Peripheral nerve injury, scarring, and recovery}, \textit{Connect. Tissue Res.} \textbf{60} (2019), 3--9.

\bibitem{Wojtkiewicz2015} Wojtkiewicz D.M., Saunders J., Domeshek L., Novak C.B., Kaskutas V., Mackinnon S.E., \href{https://doi.org/10.1007/s11552-014-9692-0}{Social impact of peripheral nerve injuries}, \textit{HAND} \textbf{10} (2015), no.~2, 161--167.

\bibitem{Xia2024} Xia K., Liu S., Wu Z., Jiang J.H., \href{https://doi.org/10.1002/cbic.202400856}{Research status and applications of adeno-associated virus}, \textit{Chembiochem.}, to appear.

\bibitem{Xu2020} Xu X., Mee T., Jia X., \href{https://doi.org/10.1080/10409238.2020.1726279}{New era of optogenetics: from the central to peripheral nervous system}, \textit{Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol.} \textbf{55} (2020), no.~1, 1--16.

\bibitem{Yegiyants2010} Yegiyants S., Dayicioglu D., Kardashian G., Panthaki Z., \href{https://doi.org/10.1097/SCS.0b013e3181e17aef}{Traumatic peripheral nerve injury: A wartime review}, \textit{J. Craniofac. Surg.} \textbf{21} (2010), no.~4, 998--1001.

\bibitem{Zumbusch2024} Zumbusch A.S., McEachern E.L.F., Morgan O.B., Nickner E., Mogil J.S., \href{https://doi.org/10.1016/j.jpain.2024.01.333}{Normative preclinical algesiometry data on the von frey and radiant heat paw-withdrawal tests: An analysis of data from more than 8,000 mice over 20 years}, \textit{J. Pain}. \textbf{25} (2024), no.~7, 104468.

\end{thebibliography}

\newpage

{\selectlanguage{english}

\ArticleName{Introduction of adeno-associated viral vectors into \\ the rat sciatic nerve for further optogenetic study}

\ShortArticleName{Introduction of viral vectors into the nerve for optogenetic studies}

\Author{Valeriia USTYMENKO~$^{\rm 1}$, Ruslana FYLYMONOVA~$^{\rm 2}$, Valentyn YARYNKA~$^{\rm 3}$,\\  Nana VOITENKO~$^{\rm 4}$}

\AuthorNameForHeading{V.~Ustymenko, R.~Fylymonova, V.~Yarynka, N.~Voitenko}

\Address{$^{\rm 1)}$~Bogomoletz Institute of Physiology of NAS of Ukraine;\\
\hphantom{$^{\rm 1)}$}~Dobrobut Academy Medical School, Kyiv, Ukraine}
\EmailD{valusty@biph.kiev.ua}
\orcidD{0009-0000-2241-435X}

\Address{$^{\rm 2)}$~Kyiv Academic University, Kyiv, Ukraine}
\EmailD{r.fylymonova@kau.edu.ua}
\orcidD{0009-0007-5528-488X}

\Address{$^{\rm 3)}$~Kyiv Academic University, Kyiv, Ukraine}
\EmailD{v.yarynka@kau.edu.ua}
\orcidD{0009-0009-4905-3043}

\Address{$^{\rm 4)}$~Kyiv Academic University; Dobrobut Academy Medical School, Kyiv, Ukraine}

\ArticleDates{Received April 19, 2025, in the final form June 7, 2025}

\AbstractEng{Peripheral nerve injuries are a significant clinical problem of our time, especially in the context of wartime, which is often accompanied by significant physiological disorders or loss of limb functionality. According to statistical data, peripheral nerve injury in civilian patients with trauma is about 2.8\%, and there are no relevant data regarding military personnel. Unfortunately, the current conventional morphological and functional nerve repair approaches do not provide stable results and still require further improvement.
In this study, we assessed the efficacy of introducing adeno-associated viral vectors that provide expression of the light-sensitive ion channel channelrhodopsin as a potential method for monitoring the regeneration process of the damaged peripheral nerve. The photoactivation of such ion channels in the recovered peripheral nerves could potentially allow the mapping of the areas of innervation recovery. First, we performed surgery with the injection of AAV1-CAG-ChR2-mCherry vectors under the epineural membrane at the proximal end of the sciatic nerve towards the spinal cord. Five weeks after surgery, the expression of channelrhodopsin in the peripheral terminals was tested by stimulation with 450 nm light, resulting in the withdrawal of the operated limb from the glass surface. The results showed that the injection of adeno-associated viral vectors has diagnostic potential in the field of peripheral nerve injury.}

\KeywordsEng{peripheral nerve injury; sciatic nerve; channelrhodopsin 2; adeno-associated viral vectors; innervation; regeneration}

}
\end{document} 